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L’anticorpo monoclonale alphaD11 riconosce con elevata affinità e specificità la neurotrofina NGF (Nerve Growth Factor) neutralizzandone efficacemente l’interazione con il recettore ad alta affinità TrkA che ne media gran parte dell’attività biologica. Questa attività antagonista è stata ampiamente sfruttata sia in vitro che in vivo, in particolare per inibire l'attività di NGF legata a stati patologici in modelli animali rilevanti per il dolore cronico e infiammatorio. Considerando l’elevata specificità e capacità neutralizzante, questo anticorpo è un potenziale bioterapeutico per il trattamento degli stati patologici in cui un eccesso di espressione e/o attività di NGF risulta deleteria.
L'applicazione clinica di anticorpi di origine animale è ostacolata dalla loro immunogenicità nell'uomo. Per ovviare questa problematica quindi è necessario umanizzarli per un impiego terapeutico efficace e sicuro. Un passaggio chiave nei metodi di umanizzazione è la selezione delle regioni FRs (Framework Regions) umane accettrici. Per superare i limiti del tradizionale metodo di CDR (Complementary Determining Regions) grafting, abbiamo sfruttato la struttura 3D dell’anticorpo in formato Fab al fine di sviluppare un nuovo approccio di selezione delle FRs umane basato su dati cristallografici: tale metodo è stato poi applicato per l’umanizzazione dell’anticorpo alphaD11 [1,2].
Il nostro nuovo approccio si basa sul confronto della struttura sia primaria (% di omologia/identità) che terziaria (grado di somiglianza strutturale fra Ca dei backbones) tra l’anticorpo parentale da umanizzare e tutti gli anticorpi umani/umanizzati la cui struttura sia stata risolta sperimentalmente a elevata risoluzione (non inferiore 2.5 Å) e depositata nel database PDB. Un gruppo di possibili FRs accettori è stato identificato sulla base del massimo livello di omologia / identità delle sequenze. Successivamente ogni struttura selezionata è stata sovrapposta alla struttura dell’anticorpo parentale ed è stata calcolata la RMSD (root mean square deviation) prendendo in esame solo le coppie di Ca con una distanza inferiore a 2 Å. Di conseguenza la scelta del FR accettore ottimale per l’umanizzazione si configura come un problema a tre variabili, rappresentabile da un grafico a dispersione 3D che combina le informazioni provenienti sia dal confronto della struttura primaria (% di omologia o identità) che dall'allineamento strutturale (il grado di similitudine strutturale espresso in termini di RMSD e di % di atomi Ca impiegati nel calcolo dell’RMSD stessa). Confrontando ogni possibile accettore con la posizione ottimale nello spazio 3D (che ciascun anticorpo occuperebbe se fosse di origine umana), è possibile identificare chiaramente l’anticorpo umano o umanizzato più vicino a questa posizione ideale sia a livello della struttura primaria che terziaria. Successivamente al CDR grafting delle CDR parentali nelle FRs umane accettrici selezionate, sono state effettuate una serie di retro-mutazioni (per preservare l'interfaccia molecolare tra i domini variabili VH e VK, per minimizzare le differenze di residui nella zona Vernier e per conservare la sequenza consenso umana/umanizzata). Il modello 3D del frammento Fab della versione umanizzata alphaD11 (hu-alphaD11) è stato perfezionato con tecniche di minimizzazione energetica per diminuire la probabilità di sovrapposizioni strutturali e di contatti di van der Waals energeticamente sfavorevoli (Figura 1).

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Figura 1. Confronto struttura terziaria: allineamento strutturale tra i domini variabili parentali (PDB_ID. 1ZAN) in magenta (A) con i FRs accettori selezionati (PDB_ID. 1JPS) (in ciano) e (B) con il modello dell'anticorpo umanizzato risultante dopo CDR grafting (le cui FRs sono in azzurro, mentre le CDR sono in magenta); (C) Modello della forma umanizzata dopo CDR grafting e ottimizzazione mediante mutagenesi (i residui di origine umana e animale sono evidenziati in ciano e viola, rispettivamente).

I domini VH e VK di sono stati costruiti sinteticamente mediante overlap assembly PCR, clonati sia in vettori di espressione eucariotici per ottenerli in formato IgG1 che in un vettore di espressione batterica dicistronico con targeting periplasmatico costruito ad hoc per produrli in formato Fab. A seguito di simulazioni di docking, la Figura 2 mostra il modello del complesso fra hu-alphaD11 in formato Fab e l’NGF umano (hNGF), che è stato validato sperimentalmente mediante SAXS (Small Angle X-ray Scattering) [3].

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Figura 2. Modello di docking del complesso 2:1 hu-alphaD11 Fab-hNGF. L’hNGF è colorato in blu, con l’epitopo riconosciuto dall’anticorpo, ovvero i loops I e II in verde ed in ciano rispettivamente. Le catene L and the H di hu-alphaD11 Fab sono colorate in celeste e verde chiaro, rispettivamente con le CDR L1, L2, L3 in rosso e le CDR H1, H2, H3 in giallo.

L'anticorpo umanizzato hu-alphaD11 è stato confrontato con il parentale sia in vitro (mediante saggi di inibizione della crescita dei neuriti su PC12 e della autofosforilazione del recettore TrkA indotta da NGF in cellule 3T3 TrkA che esprimono ectopicamente TrkA umano) che in vivo (mediante il test della formalina, un modello animale classico per il dolore infiammatorio), mantenendo sia la modalità di legame che la capacità di neutralizzare l’attività biologica della neurotrofina NGF e mostrando inoltre un significativo miglioramento nell’affinità (verificato mediante saggi ELISA e misure BiaCore). Questi risultati confermano che hu-alphaD11 possa essere un promettente candidato per l’applicazione clinica nell’area terapeutica del trattamento del dolore. Più in generale, il nostro metodo di umanizzazione su base strutturale rappresenta un notevole miglioramento rispetto ai metodi di umanizzazione standard, che sono intrinsecamente empirici e richiedono diversi cicli di affinamento per mantenere le caratteristiche dell’anticorpo parentale.

Il brevetto (PCT: WO2005/061540) relativo al metodo di umanizzazione e alla versione umanizzata di alphaD11 è stato sviluppato in collaborazione con la Scuola Superiore Internazionale di Studi Avanzati di Trieste e la LayLine Genomics SpA di Roma ed è stato oggetto di concessioni di licenze di brevetti in uso esclusivo da parte di Pangenetics B.V., Abbott Research B.V., BioXell S.p.A. e Glenmark Pharmaceuticals. La versione umanizzata di alphaD11 è stata acquisita da parte di Pangenetics B.V. e successivamente da Abbott Research B.V.

Referenze:

  1. Cattaneo A, Covaceuszach S, Lamba D (2005) Methods for the humanization of antibodies and humanized antibodies thereby obtained. Patent WO/2005/061540.
  2. Covaceuszach S, Marinelli S, Ugolini G, Krastanova I, Pavone F, Lamba D, Cattaneo A (2012) Single Cycle Structure-Based Humanization of an Anti-Nerve Growth Factor Therapeutic Antibody. PLoS ONE 7: e32212
  3. Covaceuszach S, Cassetta A, Konarev PV, Gonfloni S, Rudolph R, Svergun DI, Lamba D, Cattaneo A (2008) Dissecting NGF Interactions with TrkA and p75 Receptors by Structural and Functional Studies of an Anti-NGF Neutralizing Antibody. J. Mol Biol. 381, 881.

IC-CNR  sonia.covaceuszach@ic.cnr.it

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