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Qualità e sicurezza rappresentano oggigiorno un binomio fondamentale nella produzione e commercializzazione degli alimenti. In tale contesto, la ricerca scientifica è fortemente coinvolta nello sviluppo di metodi innovativi a basso impatto ambientale sia per l’analisi qualitativa sia per la determinazione analitica di composti potenzialmente tossici per la salute dell’uomo. In questo contesto, la tecnologia dei biosensori rappresenta una frontiera pionieristica nel controllo della qualità e della sicurezza alimentare.
L’adozione di un approccio integrato di tecniche di bioinformatica, biologia molecolare e sintesi chimica ha reso possibile la realizzazione di nuovi bio-recettori stabili e selettivi per il rilevamento di erbicidi.
Attraverso una strategia di evoluzione diretta in vitro della proteina D1 del fotosistema II di Chlamydomonas reinhardtii, abbiamo sintetizzato una libreria di mutanti algali selezionati con diverso grado di tolleranza alle radiazioni (Figura A). Questo approccio si è rivelato efficace per identificare le mutazioni della proteina D1 in grado di conferire una maggiore vitalità, tolleranza a stress indotto da radicali, e diversa competenza per il rilevamento di erbicidi. In quest’ultimo ambito, studi dose-risposta hanno indicato che tali ceppi hanno acquisito sensibilità o resistenza a erbicidi triazinici ed ureici con valori di I50 compresi tra 6x10-8M e 2x10-6 M. In parallelo, studi di dinamica e docking molecolare hanno permesso di identificare singole sostituzioni amminoacidiche nella proteina D1 in grado di conferire una maggiore affinità per l’erbicida atrazina rispetto al wild-type (Figura B). In particolare, si è dimostrato che la sostituzione della Phe256 con residui di Thr o Ser stabilizza l’interazione dell’atrazina al sito di legame mediante la formazione di nuovi legami idrogeno. Infine, mediante modeling molecolare e sintesi proteica automatica sono stati disegnati e prodotti nuovi peptidi, basati sulla struttura della proteina D1 del PSII di C. reinhardtii, in grado di legare l’erbicida atrazina. In particolare, la sequenza della proteina D1 è stata minimizzata ricostruendo il sito di legame per l’atrazina, sia in forma nativa che mutata per aumentarne la stabilità e la solubilità (Figura C). Le dinamiche di interazione peptide/ligando e la stabilità strutturale dei peptidi sono state studiate mediante tecniche di dicroismo circolare, che hanno suggerito strutture -elica tipiche delle macromolecole opportunamente ricostituite, mentre la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) ha fornito una completa caratterizzazione termodinamica dell'interazione molecolare tra i peptidi sintetici e il target atrazina. Il peptide mutato D1PepMut ha dimostrato attività di legame per l’atrazina ad alta affinità (Kd = 2.84 mM), e un contributo entalpico favorevole (DH = -11,9 kcal / mol). Studi di spettroscopia di fluorescenza hanno confermato tali dati mediante curve di titolazione iperboliche indicando la presenza di un singolo sito di legame per l’atrazina.

A. Mutanti della proteina D1 del PSII di C. reinhardtii ottenuti mediante evoluzione diretta in vitro.

B.Simulazioni di dinamica molecolaredel sito di legame per l’atrazina.

C. Docking molecolare del complessoD1PepMut- atrazina.

Ic 05

IC-CNR giuseppina.rea@ic.cnr.it

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